X
تبلیغات
حرم فلش-طراحی-کد وبلاگ-کد جاوا
microbiology.puz.blogfa.com - آزمایشگاه میکروبیولوژی محیط
آزمایشگاه میکروبیولوژی محیط
1-2-شاخص های میکروبی آلودگی مدفوعی آب:

  شاخصهای میکروبی آلودگی مدفوعی آب شامل کل کلیفرم ها و کلیفرم های مدفوعی و استرپتوکوک های مدفوعی و کلستریدیوم پرفرنژنس می باشد. میکروارگانیسم های دیگر نیز می توانند به عنوان شاخص های آلودگی مدفوعی در شرایط معینی به کار بروند. باید توجه داشت از آنجا که ویروس های روده ای و کیست بعضی از انگل ها مقاوم تر از کلیفرم ها نسبت به ضد عفونی کننده ها هستند لذا عدم حضورآنها در آب لزوما نمی تواند نشان دهنده عدم حضور ویروس های روده ای و کیست بعضی از انگل ها  باشد.

شاخص های میکروبی آلودگی مدفوعی آب شامل كل کلیفرم ها، کلیفرم هاي مدفوعی، استرپتوکوک های مدفوعی و کلستریدیوم پرفرنژنس می باشد. میکروارگانیسم های دیگر نیز می توانند به عنوان شاخص های آلودگی مدفوعی در شرایط معینی به کار بروند. باید توجه داشت از آنجا که  ویروسهای روده ای و کیست بعضی از انگل ها مقاومتر از کلیفرمها نسبت به ضد عفونی کننده ها  هستند،  لذا عدم حضور آنها در آب، لزوما نمي تواند نشاندهنده عدم حضور ویروسهای روده ای و کیست بعضی از انگل ها باشد.

1-1-2- کل کلیفرم ها

اين گروه شامل باکتری های هوازی و بی هوازی اختیاری ،گرم منفی، میله ای شکل، غیر اسپورزا و تخمیر کننده لاکتوز در دمای 35 درجه سانتیگراد همراه با تولید گاز و اسید طی 24 تا 48 ساعت مي باشند. این كليفرم ها شامل جنس هاي اشرشیا کلی، انتروباکتر، کلبسیلا  و سیتروباکتر است.  منشا کلیفرمها ممکن است خاک و مواد آلي در حال تجزيه و يا فضولات حیوانی و انسانی باشد. لذا با انجام آزمایش وجود یا عدم وجود کلیفرمهای مدفوعی می توان به منشا آلودگی پی برد

۲-۱-۲-کلیفرم های مدفوعی 

به اين گروه کلیفرم های مقاوم در برابر حرارت نيز اطلاق مي گردد كه قادر به تخمیر لاکتوز در دمای 5/44 درجه سانتیگراد هستند.این گروه كليفرم هاي مدفوعي شامل اشرشیا کلی و کلبسیلا پنومونیه می باشد و حضور آنها نشاندهنده آلودگي آب به فضولات انساني و/يا حیوانات خونگرم است.

۳-۱-۲-استرپتوکوک های مدفوعی

 استرپتوکوک ها اختصاصا به صورت زنجیره مرکب از 4 تا 6 کوکوس و گاهی 50 یا بیشتر دیده می شود این باکتریها بی حرکت، بدون اسپور و معدودی دارای کپسول هستند. دمای رشد آنها بین 15 تا 45 درجه سانتیگراد بسته به گونه متغیر است. استرپتوکوک های مدفوعی به آن دسته از استرپتوکوکها اطلاق می شود که عموما در مدفوع انسان و حیوانات وجود دارند این گروه شامل استرپتوکوکوس فکالیس، استرپتوکوکوس بویس، استرپتوکوکوس اکوئينوس و استرپتوکوکوس آویوم هستند. این میکروارگانیسم ها عموما در دستگاه گوارش انسان و حیوانات زندگی می کنند و به ندرت در آب تکثیر یافته و همچنین مقاومتر از اشرشیا کلی و سایر کلیفرم ها هستند.

۴-۱-۲کلستریدیوم پرفرنژنس

باکتری ی هوازی،گرم مثبت، اسپورزا، میله ای شکل و احیا کننده سولفیت است و در کولون یافت می شودن و نماینده تقریبا 5/0 درصد میکروفلورای مدفوعی است. اسپور آنها کاملا نسبت به شرايط نامساعد محیطی و به گندزدایی مقاومت نشان می دهد در نتیجه استفاده از این میکروارگانیسم به عنوان یک شاخص آلودگی قدیمی آب پیشنهاد می گردد.

2-2 روشهای آزمایش میکروبی آب در خصوص کلی فرم ها:

روشهای آزمایش میکروبی آب در خصوص کلی فرم ها به دو روش انجام می گیرد که عبارتند از:

1-2-2- تخمیر چند لوله ای

این روش برای آزمایش نمونه های آب آشامیدنی، غیرآشامیدنی، نمونه های حاوی نمک یا آب شور، به علاوه نمونه های گل ولای، رسوبات و لجن کاربرد دارد. دقت این روش نسبتا کم است مگر اینکه تعداد نمونه های تهیه شده زیاد باشد.

  ۲.۲.۲صافی های غشایی 

از این روش، چون حجم زیادی از نمونه را می توان مورد آزمایش قرار داد و نتایج آن را سریع تر از روش تخمیر چند لوله ای بدست آورد، بسیار استفاده می شود. این روش در آزمایش های آب آشامیدنی، آب های شور و انواع آب های طبیعی بسیار مفید است، در حالی که برای آبهای با کدورت بالا مانند فاضلاب و یا آب های فاقد کلی فرم، روش مناسبی نیست(به ویژه به علت کدورت زیاد فاضلابی که مرحله تصفیه اولیه و کلرزنی را طی کرده و همچنین برای فاضلاب حاوی فلزات و مواد آلی سمی مثل فنل ها، روش مطلوبی نیست).

1-2-2- روش تخمیر چند لوله ای:

مقدمه:

تراکم باکتریهای کلیفرم را می توان از طریق آزمایش تخمیر چند لوله ای تعیین نمود. این تکنیک محتمل ترین تعداد MPN)) کلی فرم ها در 100 میلی لیتر از آب را ارائه  نموده و یک روش غیر مستقیم بر اساس احتمالات آماری و مشاهده گاز در لوله های کشت شده می باشد.

در این آزمایش می توان از چهار روش 5 لوله ای،9 لوله ای، 10 لوله ای و15 لوله ای استفاده نمود. روش متداول در انجام آزمایش روش 9 لوله ای است که به آن می پردازیم:

1-1-2-2- تست احتمالی

مواد و وسایل مورد نیاز:

1-محیط کشت لاکتوز براث يا محیط کشت لوریل تریپتوز براث، آب رقيق سازي

2-لوله های آزمایش حاوي لوله دورهام به همراه جا لوله ای

3-چراغ الکلی، آنس یا لوپ، پیپت و پوآر

روش آزمایش:

محیط کشت لاکتوز براث مطابق دستورالعمل کارخانه سازنده تهیه و در لوله های آزمایش تقسیم مي شود به این صورت که سه ردیف سه تایی لوله آزمایش را در یک جا لوله ای آماده کرده سه لوله ردیف اول حاوی 10 میلی لیتر محیط کشت غلیظ (باغلظت دو برابر) است. لوله های ردیف دوم و سوم همه حاوی 10 میلی لیتر از محیط کشت با غلظت معمولی (غلظت یک برابر) می باشند. نمونه هایی که از غلظت بالایی برخوردارند باید رقیق سازی شوند که در فصل اول توضیح داده شده است. سپس جهت اضافه نمودن نمونه به محیط کشت به روش زیر عمل می کنیم:

1-ظروف حاوی نمونه ها و محلول های رقیق شده را 25 بار به شدت تکان می دهیم.

2-به کمک یک پیپت سترون، 10 میلی لیتر نمونه از بطری در هر یک از سه لوله اول(که غلظت محیط کشت در آنها دو برابر است) ریخته می شود.

3-به کمک یک پیپت سترون، 1 میلی لیتر نمونه از بطری به هر یک از سه لوله دوم ریخته می شود.

4-به کمک یک پیپت سترون، 1/0 میلی لیتر نمونه از بطری در هر یک از سه لوله سوم ریخته می شود.

 کلیه این عملیات باید در شرایط آسپتیک و با دقت انجام شود که از آلودگی های ثانوی مبرا باشد. لوله ها را کمی به آرامی حرکت داده تا نمونه و محیط مخلوط شود در لوله های دورهام نباید هیچگونه گاز یا حبابی از هوا وجود داشته باشد سپس آن را در انکوباتور 5/0±35 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت قرار داده در صورتیکه در لوله ی دورهام گاز تولید شده باشد آن را مثبت تلقی مي كنيم  و اگر لوله ای فاقد گاز بود آن را برای مدت 24 ساعت دیگر درانکوباتور قرار مي دهيم. پس از انقضا مدت مجددا لوله ها را بازدید کرده و موارد مثبت یا منفی را یادداشت می نمائيم.  وجود گاز پس از 48 ساعت دلیل بر مثبت بودن آزمایش است و اگر در هیچ یک گازی مشاهده نشد آزمایش احتمالی منفی است. نتایج این مرحله را بر حسب رقت و تعداد لوله های مثبت بصورت کد سه رقمی یادداشت می کنیم.

تفسير نتايج:

توليد گاز يا رشد اسيدي در لوله ها يا بطري ها طي 48 ساعت بيانگر پاسخ مثبت به آزمايش احتمالي است. لوله هاي مثبت را براي آزمايش در مرحله تاييدي نگهداري مي كنيم. عدم رشد اسيدي يا تشكيل گاز در پايان48 ساعت بيانگر نتيجه منفي است. محدود نمودن زمان به 48 ساعت براي نتيجه گيري قطعي از مشاهدات، باعث مي شود كه برخي گونه هاي نادر كليفرمها كه رشدشان بسيار كند است، از نظر دور نمانند.

2-1-2-2- آزمایش تاییدی :

مواد و وسایل مورد نیاز:

1-محیط کشت برليانت گرين لاکتوز بايل براث (BGBB)

2- لوله های آزمایش حاوي لوله دورهام به همراه جا لوله ای

3- چراغ الکلی، آنس یا لوپ، پیپت و پوآر

 روش آزمایش:

در این روش از محیط کشت BGB broth استفاده می شود. این محیط نیز طبق دستور کارخانه سازنده آماده و در لوله های آزمایش حاوی لوله دورهام توزیع و استریل مي گردد. تمام لوله ها يا بطري هاي آزمايش مرحله احتمالي كه پس از 24 يا 48 ساعت گرماگذاري، رشد زياد، تشكيل هر ميزان گاز و يا رشد اسيدي در آنها مشاهده شده است، براي مرحله تاييدي آزمايش مي شوند. چنانچه فعاليت تخميري يا رشد اسيدي زياد، در لوله هاي اوليه زودتر از 24 ساعت ظاهر گرديد، مي توان آنها را پيش از اتمام زمان 24 ساعت  به مرحله تاييدي منتقل نمود. لوله ها يا بطري هاي مرحله اول را كه توليد گاز و اسيد در آنها مشاهده مي شود به آرامي چرخانده يا تكان مي دهيم تا ميكروارگانيزم ها در آن به صورت شناور درآيند. با يك لوپ فلزي استريل به قطر 3 ميليمتر، يك لوپ(قطره) كامل از كشت ميكروبي داخل لوله را به لوله تخمير دوم حاوي محيط BGB broth منتقل مي کنیم. لوله هاي حاوي محيط كشت و نمونه را كه در اين مرحله آماده شده اند به مدت 48 ساعت در 5/0± 35 در جه سانتيگراد گرماگذاري مي کنیم. سپس کد سه رقمی را بر اساس تعداد لوله های مثبت هر رقت یادداشت می نمائیم.

تفسير نتايج:

تشكيل گاز به هر ميزان، در لوله هاي درهام در هر زمان از 48 ساعت گرماگذاري، بيانگرپاسخ مثبت در اين مرحله است. مقدار محتملترین تعداد کلیفرم در 100 میلی لیتر آب از تعداد لوله هاي مثبت اين مرحله با استفاده از جدول یا فرمول تعیین یا محاسبه مي گردد.

3-2-محاسبه و گزارش MPN:

براي محاسبه غلظت يا تراكم باكتريها از روش بيان آماري محتمل ترين تعداد يا بيشترين تعداد احتمالي(MPN) استفاده مي شود. مقادير MPNبراي آزمايش هاي بسيار متنوعي كه بر روي نمونه هاي گوناگون صورت گرفته محاسبه و در جداول مختلف درج گرديده است. اين ارقام با در نظر گرفتن محدوده اطمينان95% براي هر MPN محاسبه شده است. اگر حجم نمونه هاي تهيه شده در يك آزمايش همان مقاديري باشد كه در جدول وجود دارند مي توان MPN مربوط به آن آزمايش را بر حسب 100ml/MPN  از جدول يافته و گزارش نمود.

اعداد جدول 3-1 مربوط به نتايج مثبت آزمايش 5 لوله ي 20 ميلي ليتري و ارقام جدول 4-1 براي پاسخ مثبت به 10 لوله 10 ميلي ليتري است در حالي كه جدول 2-1 نتايج MPN براي تركيبي از پاسخ هاي مثبت و منفي آزمايش 9 لوله اي است كه 3 عدد آن حاوي 10 ميلي ليتر ، 3 عدد آن 1 ميلي ليتر و 3 عدد  آخر حاوی  1/0 ميلي ليتر از نمونه مورد بررسي است.

زماني كه ميزان رقت يا ضريب رقيق سازي به اعداد 10 ،1 و 1/0 متفاوت باشد مي توان MPN  را براي تركيبي از لوله هاي مثبت از جدول 2-1 انتخاب نموده و به كمك فرمول زير آن را براي آزمايش انجام شده محاسبه و گزارش نمود.

                                               غلیظ ترین حجم انتخابیMPN×10/ بدست آمده از جدول= MPN/100ml  

اگر در يك سري لوله با رقت هاي بيش از سه نوع رقت استاندارد وجود داشته باشد تنها نتايج سه گروه استفاده مي شود. براي انتخاب اين سه گروه، بالاترين ميزان رقتي (يا رقيق ترين نمونه اي )كه هر 3 لوله آن پاسخ مثبت به آزمايش داده است به همراه دو گروه بعدي از لوله ها كه به ترتيب رقيق تر هستند براي محاسبه MPN در نظر گرفته مي شوند .به شكل زير توجه كنيد.

زماني كه تركيبي از لوله هاي مثبت در جدول يافت نشود، مي توان MPN را از فرمول ساده توماس به صورت زير محاسبه نمود:

 

 3-1-2-2- آزمایش تکمیلی   

براي اطمينان از حضور باكتري هاي كليفرم و تهيه اطلاعات كنترل كيفي، آزمايش تكميلي را روي حداقل 10 درصد لوله هاي مثبت مرحله تاييدي انجام مي دهند. در اين مرحله، از روش تاييد مضاعف يعني استفاده مجدد از محيط كشت  BGB broth براي كل كليفرم ها و EC broth براي كليفرمهاي مدفوعي كمك گرفته مي شود. بايد توجه داشت كه پاسخ مثبت به EC broth در دماي بالا (5/44 درجه سانتيگراد) بيانگر نتيجه مثبت مرحله تكميلي محسوب مي گردد. پاسخ مثبت لوله هاي حاوي   BGB broth  همراه با  پاسخ منفي همان نمونه ها در EC نشانگر حضور كليفرم هاي غير مدفوعي بوده و مي بايد مجددا در مرحله تكميلي براي اثبات حضور كليفرمها مورد بررسي قرار گيرد.

مواد و وسایل مورد نیاز:

1- محیط کشت اندو آگار

2-محیط کشت نوترینت آگار   

3-محیط کشت EC Broth

4-محیط کشت لاکتوز براث

5- محلولهاي رنگ آميزي گرم

5- لوله های آزمایش حاوي لوله دورهام به همراه جا لوله ای

6-چراغ الکلی، آنس یا لوپ، پیپت، پوآر و میکروسکوپ نوری و لام

روش آزمایش :

باید توجه داشت در مرحله تکمیلی دو نوع آزمایش وجود دارد 1- روش استاندارد که منجر به شناسایی باکتریهای گرم منفی، میله ای شکل و بدون اسپور می شود. این روش امروزه در مراکز اجرایی کنترل کیفی آب آشامیدنی به علت وقت گیر بودن انجام نمی گیرد.

2-روش تایید کلیفرم های مدفوعی که در محیط   EC broth استفاده می گردد. 

با حفظ شرايط سترون از هر يك از لوله هاي BGB كه در آن گاز مشاهده شده، بلافاصله پس از مشاهده گاز به كمك لوپ يك كشت خطي بر روي محيط كشت اندو آگار يا مك كانكي آگار انجام مي شود . پليت ها به گونه اي كشت خطي داده مي شود كه كلني هاي منفرد به فاصله حداقل 5/0 سانتي متر از يكديگر روي محيط كشت رشد كنند. در صورت حضور باكتريهاي گروه كليفرم براي تشكيل كلني هاي مجزا، به هنگام گسترش خطي نمونه روي آگار بايد به نكات زير توجه شود:

- از يك لوپ استريل با قطر mm 3 يا يك ميله سوزني شكل كه نوك آن كمي خميده باشد استفاده مي كنيم.

- براي اجتناب از چسبيدن لايه سطحي و يا كف روي محيط كشت به نوك سوزن يا لوپ، لوله را كمي تكان داده، كج كرده و سپس سوزن را در آن فرو مي بريم.

-انتهاي سوزن يا لوپ را در داخل مايع تا عمق تقريبا 5/0 سانتيمتري فرو برده، نمونه را بر ميداريم.

- نمونه برداشته شده را به وسيله قسمت خميده سوزن يا لوپ روي محيط كشت مي ماليم تا سطح آن خراشيده يا پاره نشود. در فاصله بين كشت مرحله دوم(ربع دوم پليت) و مرحله سوم (ربع سوم پليت) سوزن يا لوپ را حرارت مي دهيم تا ضد عفوني گردد و در نتيجه كيفيت تفكيك كلني ها بهتر صورت گيرد.

پليت ها را به صورت وارونه در انكوباتور با دماي 5/0±35 درجه سانتيگراد به مدت 24 ساعت قرارميدهيم.

كلني هاي گسترش يافته بر روي محيط كشت اندو آگار پس از 24 ساعت گرماگذاري به يكي از سه شكل 1- تيپيك يا مشخص(كلني هاي صورتي تا قرمز تيره با جلاي سبز فلزي) 2-  غير تيپيك يا غیر مشخص(صورتي، قرمز، سفيد يا بي رنگ بدون درخشش) 3– يا كلني هاي غير كليفرمی (ديگر كلني ها) مشخص مي شوند. كلني هاي تيپيك تخمير كننده لاكتوز كه بر روي محيط كشت مک کانکی آگار گسترش يافته اند قرمز هستند و ممكن است به وسيله هاله تيره كه بر اثر رسوب صفراي محيط كشت ايجاد شده احاطه شده باشند. از هر پلیت یک یا چند کلنی تیپیک کلیفرم که کاملا ایزوله (مجزا) شده اند بر می داریم. اگر هیچ کلنی تیپیک موجود نباشد از دو یا چند کلنی که بیشترین شباهت را با ارگانیسم های گروه کلیفرم دارند برداشت می کنیم. از هر کلنی کاملا مجزا به هر دو لوله تخمیر حاوی لاکتوز براث و آگار مغذی(نوترينت آگار) شیب دار انتقال می دهیم.

در صورت نیاز به مشاهده و شناسایی دقیق کلنی ها به هنگام برداشت آنها از محیط کشت اندو آگار یا مک کانکی آگار از ذره بین استفاده می کنیم. هنگام انتقال هر کلنی یک کلنی کاملا مجزا را انتخاب کرده و سپس نوک سوزن سترون شده را فقط با سطح کلنی تماس داده و از آن برداشت می کنیم و به این ترتیب احتمال انتقال یک کشت مخلوط (آلوده شدن کشت به هنگام انتقال ) را به حداقل می رسانیم.

لوله ها حاوی کشت ثانویه لاکتوز براث که لوله های درهام در آن وجود دارند را به مدت 24 ساعت در دمای 5/0±35 درجه سانتیگراد گرماگذاری می کنیم. اگر گاز تولید نشده،مجددا به مدت 24 ساعت دیگر گرماگذاری می کنیم. وجود گاز را بعد از 48 ساعت بررسی می کنیم در صورت تشکیل گاز در لوله های کشت ثانویه، لوله های کشت آگار شيب دار مربوط به هر لوله را مشخص کرده و با روش رنگ آمیزی گرم و بررسی میکروسکوپی آزمایش می کنیم.

تفسير آزمايش:

تشكيل گاز در دومين سري لوله هاي حاوي محيط كشت آبگوشت لاكتوز براث در مدت 48 ساعت و مشاهده باسيل هاي گرم منفي و بدون اسپور كه برروي محيط كشت آگار رشد كرده است نشانه مثبت بودن مرحله تكميلي و حضور باكتريهاي گروه كليفرم است.

4-2-  روش صافي هاي غشايي:

تئوري آزمايش:

علاوه بر آزمايش تخمير چند لوله اي، روش ديگر قابل استفاده و شناخته شده، روش صافي هاي غشايي است. ديسك هاي صافي به ضخامت 150 ميكرومتر مي باشد كه سوراخهايي به قطر 45/0 ميكرون دارند. در اين آزمايش ابتدا نمونه اي از آب از صافي عبور داده مي شود تمام باكتريهاي موجود در نمونه روي سطح صافي باقي مي مانند سپس صافي را روي صفحه جاذب اشباع شده با محيط كشت مغذي مي گذارند و به مدت 22 تا 24 ساعت در انكوباتور قرار داده مي شود. ارگانيسم ها روي ديسك صافي كلني هايي تشكيل مي دهند كه مي توان آن را زير ميكروسكوپ شمارش كرد. در محيط كشت اندو آگار كلني هاي تشكيل شده داراي جلاي طلايي رنگ براق مي باشد مزاياي اين روش نسبت به MPN عبارتند از1- از دزجه بالاي قابليت تكثير كلني ها روي سطح صفحه جاذب برخوردار است 2- بدليل حساسيت بيشتر، از حجم هاي بيشتر آب مي توان استفاده كرد3- زمان كمتري حدود 4/1 روش MPN براي دست يافتن به نتيجه، مورد نياز است.

مواد و وسايل مورد نياز:

1-ديسك هاي صافي به ضخامت 150 ميكرون وداراي سوراخهايي به قطر45/0 ميكرون

2-ست فيلتراسيون غشايي

3-محيط اندو آگار

4-پمپ خلا- نمونه هاي آب – پيپت 5 ميلي ليتري- ديسك جاذب استريل-(پتري ديش پلاستيكي – ارلن 1000 ميلي ليتري و درپوش پلاستيكي)

 

روش آزمایش:

در صورتي كه سٍت فيلتراسيون كامل بود آزمايش را انجام مي دهيم در غير اينصورت به شرح زير عمل مي نماييم:

1-پتري ديش پلاستيكي كوچكي را به صورت زير آماده مي كنيم:

الف) با يك گيره استريل، صفحه جاذب استریل را به یک پتری دیش استریل منتقل می کنیم.

ب) با استفاده از یک پی پت 5 میلی لیتر، 2 میلی لیتر از محیط کشت اندو آگار را روی صفحه جاذب ریخته بصورتی که صفحه جاذب از محیط کشت مورد نظر اشباع شود.

2-جمع کردن وسایل صافی بصورت زیر انجام می گیرد:

الف) با جلوگیری از آلودگی وسایل، پایه نگهدارنده فیلتر را در گلویی فلاسک یک لیتری قرار می دهیم.

ب) با یک گیره استریل، بصورت عمودی، صافی غشائی استریل را روی پایه نگهدارنده صافی قرار می دهیم.

ج) قیف صاف سازی را روی صفحه جاذب قرار داده و برای اطمینان آنرا با یک گیره به پایه وصل می کنیم.

3- لوله پلاستیکی متصل به ارلن یک لیتری را به پمپ خلا وصل کرده و مقدار مشخصی از نمونه آب را داخل قیف می ریزیم میزان آب مورد استفاده بستگی به کیفیت آب دارد ولی مقدار آن نباید کمتر از 50 سی سی باشد. در آبهای با باکتری کم و کدورت کم میزان نمونه باید بیش از 200 میلی لیتر باشد. برای برداشت نمونه آب از یک استوانه مدرج استریل استفاده می کنیم.

4-کناره های داخلی قیف را با 20 میلی لیتر آب استریل شستشو می دهیم.

5-پمپ خلا را خاموش کرده، قیف را برداشته و با دقت توسط گیره استریل، صافی را به پتری دیش حاوی محیط کشت آبگوشت اندو آگار منتقل می کنیم.

6-پتری دیش را در انکوباتور در دمای 35 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت قرار می دهیم و بعد پتری دیش را وارونه می کنیم.

7-بعد از انکوباسیون صافی را از داخل پتری دیش برداشته و روی کاغذ جاذب به مدت یک ساعت خشک می کنیم.

8-کلنی های روی صافی را شمارش کرده از کلنی هایی که فاقد جلای فلزی سبز رنگ هستند صرفنظر می کنیم. کلنی های با جلای فلزی بعد از 24 ساعت در دمای 44 درجه سانتیگراد نشان دهنده وجود کلیفرم مدفوعی هستند

5-2-آزمایش شمارش بشقابی هتروتروفیک

تئوری آزمایش:

اندازه گیری تراکم باکتریهای هتروتروف هوازی و بی هوازی اختیاری در آب به نام شمارش بشقابی هتروتروفیک نامیده می شود. (باکتری های هتروتروف انرژی خود را از طریق اکسیداسیون مواد آلی بدست می آورند همچنین مواد آلی به عنوان منبع کربن آنها می باشد). این روش، روش  استاندارد شده ای است. به خاطر اینکه بازیافتن تمام باکتری های موجود در یک نمونه آب با یک روش منحصر امکان پذیر نیست. روش های جدید برای بهبود بازیافت جمعیت باکتریایی هتروترفیک گسترش یافته است و روش ها و محیط کشت های جدید شناخته شده است. روش های مختلفی در مورد HPC وجود دارند که به آنها می پردازیم:

1-5-2-روش پورپلیت

تئوری آزمایش:

 در این روش محدوده حجم نمونه یا نمونه رقیق شده انتخابی بین 1/0 تا 2 میلی لیتر متغیر است. این روش دارای اشکالاتی است از جمله اینکه محیط حرارت دیده تا 44 الی 46 درجه سانتیگراد می تواند سبب شوک حرارتی و استرس برای باکتریها شود.

مواد و وسایل مورد نیاز:

1-محیط کشت  R2A agar

2-پتری دیش (پلیت)

3-جا لوله ای ، لوله های آزمایش

4--چراغ الکلی، آنس یا لوپ، پیپت و پوآر

 روش آزمایش:

1-محیط R2A agar را طبق دستورالعمل کارخانه سازنده تهیه می کنیم و در یخچال نگهداری می نماییم.

2-سپس این محیط ها را که بصورت جامد هستند در آب جوش بن ماری قرار داده تا محیط ها ذوب شود، سپس لوله ها را در بن ماری در دمای 45 تا 50 درجه سانتیگراد قرار می دهیم تاخنک تر شوند.

3-سپس در کنار شعله یک میلی لیتر از نمونه را وارد پتری دیش نموده و سپس محیط کشت را که قبلا ذوب شده است داخل پتری دیش ریخته و سپس به صورت عدد 8 انگلیسی به آهستگی حرکت داده تا نمونه و محیط کشت به خوبی مخلوط شوند، به این وسیله  نمونه را در تمام سطح محیط پخش می کنیم.

4-پلیت ها را در 37 درجه سانتیگراد به مدت 24 تا 48 ساعت قرار می دهیم. 

2-5-2-روش اسپرید پلیت

تئوری آزمایش:

 در این روش شوک حرارتی ایجاد شده بوسیله آگار حرارت دیده وجود نداردو بعلاوه کلنی ها تماما در سطح آگار خواهد بود که به راحتی دیده می شوند و به سرعت می توان شمارش را انجام داده آنها را از ذرات یا حباب های هوا تشخیص داد. عامل محدود کننده کاربرد آن به کار رفتن حجم کمتری از نمونه یا نمونه رقیق شده است.

مواد و وسایل مورد نیاز:

1-محیط کشت  R2A agar

2-پتری دیش (پلیت)، اسپریدر

3-جا لوله ای ، لوله های آزمایش

4--چراغ الکلی، آنس یا لوپ، پیپت و پوآر

روش آزمایش:

اساس این روش همانند روش قبل است با این تفاوت که نمونه را همراه محیط کشت نمی ریزیم.

1-ابتدا محیط کشت پس از تهیه و استریل در اتوکلاو در داخل پلیت ها ریخته می شود.

2-پس از سرد شدن محیط کشت، 1 سی سی از نمونه را به صورت کاملا استریل روی محیط کشت ریخته و سپس با اسپریدر[4] نمونه را در تمام سطح محیط کشت پخش می کنیم.

3-پلیت ها را در 37 درچه سانتیگراد به مدت 24 تا 48 ساعت قرار می دهیم.

شمارش و گزارش:

برای شمارش کلنی ها از واحد CFU یا واحد تشکیل کلنی استفاده می شود.

+نوشته شده در یکشنبه نوزدهم اردیبهشت 1389ساعت12:24توسط غلام علی جعفری |